Комарі з вбудованим «генетичним щитом» зупиняють малярію – рівень зараження знижується на 93%

Подолання стійкості до інсектицидів: як єдина генна модифікація у комарів саморозмножується протягом поколінь, практично усуваючи передачу малярії без шкоди для виживання.

У нещодавно опублікованому дослідженні в журналі Nature команда вчених дослідила, чи робить алель глутаміну 224 (Q224) у білку FREP1 (фібриноген-пов'язаний протеїн 1) комарів Anopheles stephensi стійкими до інфекції Plasmodium, оцінила витрати на виживання, пов'язані з цим алелем, і протестувала систему алельного генного драйву для поширення цієї захисної мутації серед популяцій.

Передумови

У 2023 році від малярії померло близько 600 000 людей, переважно діти, в країнах Африки на південь від Сахари та Південної Азії. Традиційні методи боротьби – москітні сітки, обробка інсектицидами, протималярійні препарати – втрачають свою ефективність через стійкість комарів та паразитів. Технології генного драйву, які поширюють корисні алелі через популяції комарів, пропонують перспективне та стале рішення.

Білок FREP1 допомагає паразитам перетинати середній кишечник комара, але природний варіант Q224 може запобігти інфекції, не порушуючи біологію комара. Метою було перевірити, чи може такий ендогенний алель безпечно поширюватися для зменшення передачі малярії, зберігаючи при цьому життєздатність комара.

Про дослідження

За допомогою CRISPR/Cas9 було створено два штами Anopheles stephensi, які відрізнялися лише 224-ю амінокислотою в білку FREP1: дикий тип з лейцином (L224) та потенційно захисний штам з глутаміном (Q224). Направляюча РНК була спрямована на інтронну ділянку на 126 пар основ вище за течією від кодону, що дозволяло гомологічну рекомбінацію зі вставкою флуоресцентної мітки (GFP або RFP).

Пристосованість оцінювали за довжиною крил, плодючістю, вилуплюваністю яєць, заляльковуванням, появою дорослих особин та тривалістю життя (аналіз виживання Каплана-Мейєра).

Компетентність вектора визначали за допомогою стандартного мембранного годування паразитів Plasmodium falciparum (людина) та Plasmodium berghei (гризун) з підрахунком ооцист та спорозоїтів у слинних залозах.

Система алельного драйву включала касету з гРНК проти L224 та Cas9 під контролем промотора vasa. Частоти алелів контролювали за допомогою флуоресцентних міток у багатоциклових експериментах (10 поколінь). Генотипування проводили за допомогою ПЛР, секвенування Сангера та NGS. Баєсівське моделювання оцінювало конверсію алелів, витрати на придатність та динаміку під час вільного спарювання в лабораторії.

Результати

Алель FREP1Q224 не спричинив значних втрат у виживанні: довжина крил, плодючість, вилуплення, заляльковування та вихід дорослих особин були ідентичними контрольній групі FREP1L224. Невеликі відмінності в розмірі та тривалості життя самців не впливали на конкурентоспроможність. Незаймані самки FREP1Q224 жили так само довше, як і контрольна група, а самки після кровопостачання показали лише незначне скорочення тривалості життя.

Експерименти з випробуванням виявили виражений захист у гомозигот.

• При низьких концентраціях гаметоцитів P. falciparum (0,08%):
  • Рівень зараження знизився з 80% до ~30% у FREP1Q224;
  • Середня кількість ооцист: від 3 до 0;
  • Спорозоїти у слинних залозах: від >4000 до 0.
• При вищій гаметоцитемії (0,15%):
  • Середня кількість ооцист: від ~32 до
  • Кількість спорозоїтів також різко зменшилася.
• Для P. berghei:
  • Середня кількість ооцист: від 43 до 25;
  • Спорозоїти: від ~19 000 до 11 000.
• Гетерозиготи (FREP1L224/Q224) не були захищені.

Ефективність генного драйву

• У парних схрещуваннях Cas9 + гРНК L224 перетворила від 50 до 86% алелів FREP1L224 на FREP1Q224;
• З материнським Cas9 частота була вищою;
• У 2-му поколінні частота захисного алеля досягла 93%;
• Частота помилок шляху репарації NHEJ була низькою (0–12%) і зазвичай призводила до пошкодження.
• У клітинних популяціях зі співвідношенням донор:реципієнт 1:3 частота FREP1Q224 збільшилася з 25% до >90% протягом 10 поколінь;
• Частота алелів NHEJ знизилася з 5,4% до

Баєсівське моделювання підтвердило гіпотезу про високу конверсію, низьку частоту стабільних мутацій та ефект летального стерильного мозаїцизму, де гомозиготи WT з материнським генотипом Cas9 страждали від соматичних мутацій та знижували виживання.

Пізніші покоління показали майже повне пригнічення ооцист P. falciparum (медіана від 0 до 5,5), що підтверджує, що популяція стала значною мірою стійкою до передачі паразитів.

Захисний алель не мав прихованих переваг чи побічних ефектів і поширювався за допомогою інстинкту.

Висновки

Дослідження показало, що заміна однієї амінокислоти в білку FREP1 та зміна його успадкування за допомогою генного драйву може зробити Anopheles stephensi практично імунним до малярії – як людської, так і гризучої – без шкоди для життєздатності комарів.

Цей підхід доповнює існуючі заходи (сітки, інсектициди, препарати), ефективність яких знижується через резистентність. Таку систему також можна використовувати для відновлення чутливості до інсектицидів або введення інших захисних алелів.

Перш ніж технологію можна буде впровадити, необхідні суворі екологічні, етичні та управлінські рамки, а також системи контролю за її поширенням.