Експериментальна робота з пересадки алогенних кератиноцитів на штучно створені рубці білих щурів

Бажання використовувати клітинний потенціал та необхідність пошуку нових ефективних методів покращення естетичного вигляду рубців призвели до ідеї спробувати вивчити можливість пересадки кератиноцитів на рубцеві поверхні.

Щоб довести ймовірність використання культури кератиноцитів для покращення зовнішнього вигляду рубців, було проведено експериментальне дослідження на білих лабораторних щурах, яким створювали рубцеві поверхні. Модель рубця щура була отримана в результаті загоєння штучно нанесених ран на спині, вздовж хребта. Щурам вирізали однакові шматочки шкіри, розміром 2x3 см. Через 2,5 місяці після операції «моделювання рубця» щурам проводили дермабразію (видалення верхніх шарів рубця за допомогою термокаустики) та пересаджували алогенні кератиноцити, виділені зі шкіри щурячих дитинчат через 2-4 дні після народження.

Виділення та культивування клітин епідермісу щурів проводили в лабораторії клітинних технологій Інституту цитології Російської академії наук за наступною технологією.

Шкіру промивали у фізіологічному розчині Хенка, що містив 200 Од/мл гентаміцину, та нарізали на дрібні шматочки площею 0,2-0,5 см2 ^. Шматочки шкіри інкубували у 0,5% розчині диспази у збалансованому сольовому фосфатно-буферному розчині при 37°C протягом 1 години. Потім шматочки переносили у фосфатно-буферний розчин Дульбекко та відокремлювали епідерміс від дерми. Епідерміс інкубували у 0,125% розчині трипсину протягом 10-15 хвилин при перемішуванні зі швидкістю 50 об/хв, після чого дію ферменту зупиняли додаванням 5% фетальної сироватки великої рогатої худоби. Одну третину отриманої клітинної суспензії використовували в чистому вигляді для одного з варіантів трансплантації на рубці, другу третину вирощували на біосумісних вітчизняних плівкових покриттях «Поліпор», а третю – на чашках Петрі без підкладки. Операцію дермабразії отриманих рубців у щурів з подальшою трансплантацією на них клітин епідермісу щурів проводили під ефірним наркозом за допомогою термокаутеру.

У першій групі щурів після дермабразії на поліровану, промиту фізіологічним розчином та висушену поверхню рубця розміщували стерильні шматочки батисту, на які наносили збовтану суспензію алогенних епідермоцитів щурів у концентрації 1,5 млн клітин на 1 мл (за даними Інституту цитології). Шматочки батисту розміщували на полірованому рубці таким чином, щоб клітини лежали на поверхні рубця. Зверху накладали пов'язку з кількох шарів марлі, яку пришивали до країв рубця.

Частину отриманої клітинної суспензії висівали в чашки Петрі на стерильні плівки Polypore, вирізані за формою чашок, іншу частину – на чашки Петрі без плівки. Культивування проводили в середовищі FAD, що складалося із суміші DMEM та середовища F12 у співвідношенні 3:1 з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки, 5 мкг/мл інсуліну (Sigma), 0,5 мкг/мл гідрокортизону гемісукцинату (Sigma), 10 мкг/мл епідермального фактора росту EGF (Інститут цитології РАН, Санкт-Петербург). Другу та третю групи щурів, по 7 особин кожна, прооперували через 6 днів після першої. До цього часу з суспензії висіяних кератиноцитів у чашках Петрі утворилися багатошарові шари, які пересаджували щурам. Другій групі пересаджували епідермоцити на плівці, третій – з багатошаровим шаром без підкладки. Через 7 днів отримані багатошарові шари алогенних кератиноцитів (MPALK), посіяні на плівки «Polypore», пересаджували у вигляді культури безпосередньо на поверхню рани. Зверху плівку, щоб уникнути її відриву, фіксували багатошаровою марлевою пов'язкою та пришивали до шкіри щурів.

Перед пересадкою кератиноцитів третій групі щурів, вирощених без субстрату, ПАК відокремлювали від дна чашки Петрі, обробивши його диспазою, яка має здатність вибірково порушувати дермально-епідермальні зв'язки. Впливаючи на багатошаровий шар, диспаза порушує зв'язок клітин базального шару з дном чашки Петрі та значно менший вплив має на міжклітинні зв'язки, що дозволяє повністю «зняти» шар. Відокремлення багатошарового клітинного шару диспазою здійснювали наступним чином. Транспортне середовище зливали з чашок Петрі, клітинні шари тричі промивали поживним середовищем, що містило антибіотики, зокрема, гентаміцин (0,2 мг/мл). Багатошарові шари заповнювали 0,125% розчином диспази («Sigma») та поміщали в термостат, де інкубували при t=37°C протягом 20-30 хвилин. Поява білого обідка, що відшаровується по периферії шару, є показником початку процесу його відділення від країв та дна чашки Петрі. Через кілька хвилин після початку процесу відділення розчин диспази зливали, епітеліальні шари промивали середовищем 2-3 рази. На поверхню епідермального шару накладали шматочок стерильної пов'язки для ран "Літа-колор", вирізаний за розміром чашки, до якого приклеювали шар, відокремлений диспазою, додатково відшарований від дна чашки шпателем. За допомогою очного пінцета шар разом з покриттям серветки "Літа-колор" (Росія) відривали від дна чашки Петрі та обережно переносили на підготовлену поверхню рубця. Серветки "Літа-колор" містять гентаміцин та екзолін (екстракт колагену), які при зволоженні залишками середовища росту, а потім фізіологічним розчином, набухали та ставали сучасною пов'язкою для ран, забезпечуючи хороший захист від зовнішньої інфекції та швидке загоєння завдяки вологопоглинаючій структурі.

На плівки Polypore та серветки кольору Lita накладали багатошарові марлеві пов'язки та пришивали їх до шкіри щурів для міцнішої фіксації. Кожного щура поміщали в окрему клітку для створення оптимальних умов для його утримання та приживлення пересаджених кератиноцитів. Пов'язки щурів, яким пересаджували суспензію та багатошаровий шар епідермоцитів, видалених диспазою, зволожували стерильним фізіологічним розчином кілька разів на день для створення максимально сприятливих умов для приживлення клітин. Враховуючи, що плівка Polypore була непроникною для води, пов'язки щурів другої групи не зволожували, що було однією з переваг перед трансплантатами без плівок. Пов'язки знімали через 10 днів. Клінічна картина рубців після трансплантації клітин мало чим відрізнялася від рубців без трансплантації, за винятком їх більш рожевого кольору (через дермабразію) та більшого лущення. Цей факт свідчить про те, що одразу після відпадання ранових пов'язок з ГДК змін у рубці не відбулося.

Взяття біопсійного матеріалу у щурів.

Через 1, 2, 5 та 9 місяців після трансплантації алогенних кератиноцитів щурів на поліровані рубці білих щурів було взято матеріал для гістологічного, цитоморфологічного та електронно-мікроскопічного дослідження. Як контроль брали зразки нормальної шкіри щурів та рубця без трансплантації клітин. Анестезію щурів проводили за допомогою ефірного наркозу.

Після анестезії з позначених ділянок брали шматочки рубцевої тканини, на які за допомогою біопсійного пробійника діаметром 2 мм пересаджували кератиноцити та поміщали у 2,5% розчин глутаральдегіду для підготовки матеріалу до електронно-мікроскопічного дослідження. Шматочки тканини, взяті для гістологічного дослідження, поміщали у 10% розчин нейтрального формаліну, потім пропускали через спирти та заливали в парафін, після чого вирізали надтонкі зрізи та переглядали їх у світлооптичному мікроскопі.

Контроль I. Нормальна шкіра щурів.

Щоб побачити різницю між мікроскопічним зображенням нормальної шкіри щурів зі зміненими рубцями та рубцями в певні моменти після трансплантації МПК, на всіх етапах цього дослідження показані їх фотографії та описи.

Епідерміс нормальної шкіри складається з 7-9 шарів клітин. Роговий шар має помірну товщину. Місцями він складається з 6-8 шарів рогових лусочок. Базальний шар представлений циліндричними клітинами з великими, світлими, правильної форми ядрами та кількома ядерцями. Десмосомні зв'язки між клітинами та з базальною мембраною чітко виражені. Під добре окресленою базальною мембраною, яка має невеликі вирости в субепідермальному шарі, паралельно їй лежать ніжні пучки колагенових та еластинових волокон, серед яких розташовані видовжені фібробласти, дрібні судини. У глибших шарах пучки колагенових та еластинових волокон лежать у різних напрямках. Серед них багато судин з тонкими стінками однакового калібру, клітинні елементи (фібробласти, тучні клітини, лейкоцити). Велика кількість волосяних фолікулів, сальних залоз.

Контроль 2. Шрам щура, 2 місяці.

Клінічна картина. Рубці блідо-рожеві, з лущенням, місцями залишаються скоринки. Їх площа зменшилася через скорочення колагенових волокон і стала приблизно 3,0-3,5 см ^:. Шкірні придатки відсутні.

Мікроскопічна картина. Епідерміс складається з 3-5 шарів клітин, складчастих, представлених округлими базальними клітинами, одним рядом шилоподібних, 1-2 рядами зернистих з кератогіаліновими зернами у верхньому шарі, є ділянки внутрішньоклітинного набряку. Роговий шар нерівномірно змінений від дуже тонкого до потовщеного. Відзначається рубцева складчастість за рахунок (скорочення) рубцевої тканини. Складки проникають до сосочкового шару та створюють враження сосочків. Межа між епідермісом та дермою є прямою лінією. Базальна мембрана простежується не скрізь. У нижній частині субепідермального та глибших шарах є судини з товстою, розпушеною стінкою, багато з них пустельні, зі стазом. Навколо судин відбувається скупчення макрофагів, фібробластів. Макрофаги оточують еритроцити, що вивільняються з капілярів, і фагоцитують їх. У більш поверхневих шарах є дрібні капіляри. Під епідермісом колагенові волокна розташовані пухко. У глибшому шарі рубця є грубі пучки колагенових волокон, серед яких багато фібробластів.

Шрам щура через місяць після трансплантації кератиноцитів щура.

Клінічна картина. Рубці рожевого кольору, їх площа зменшилася, особливо в діаметрі, і становить в середньому 2,5-3 см² ^. Волосся та сальні залози відсутні.

Дані мікроскопічного дослідження матеріалу, отриманого від щурів з трансплантацією MPaLK на плівку та MPaLK без підкладки, практично ідентичні. Однак, чисто технічно, робота з MPaLK без підкладки набагато складніша та кропітка, ніж при вирощуванні MPaLK на підкладці, тому при подальшому вивченні питання трансплантації кератиноцитів у рубці ми використовували багатошаровий кембрик як основу для вирощування («підкладки»).

Мікроскопічна картина. Відзначається потовщення епідермісу до 15-20 шарів, майже до середини яких кератиноцити мають вузьку, видовжену, вертикальну форму та компактне розташування. Базальні клітини розташовані нерівною лінією. Їхні ядра світлі, великі, округлі з одним або двома ядерцями, що свідчить про їх високу синтетичну та проліферативну активність. Межа між епідермісом та дермою є прямою лінією. Острий шар добре розвинений, складається з 3-5 шарів округлих клітин, є 2-ядерцеві клітини.

Безпосередньо під базальною мембраною щільно розташовані тонкі пучки колагенових волокон, паралельно їм велика кількість безлюдних судин, глибші колагенові волокна грубіші, зібрані в щільні пучки. Багато великих фібробластів, тучних клітин (2-3 в полі зору), макрофагів, лейкоцитів та безлюдних судин, стінки яких розпушені, навколо них пухко розташовані колагенові волокна. У деяких судинах спостерігається стаз, діапедез формених елементів. Навколо судин є фібробласти, поодинокі лімфоцити. Придатки шкіри відсутні.

При пересадці суспензії кератиноцитів на полірований рубець мікроскопічна картина відрізняється від попередньої. У більшості тварин епідерміс тонкий і складається з 5-6 шарів клітин. Нижній шар складається з клітин неправильної, полігональної форми з ядрами округло-неправильної форми. Стан субепідермального шару подібний до його стану в групі тварин без трансплантації MPALK.

У цьому випадку можна говорити або про затримку процесів, що супроводжують трансплантацію клітин, або про велику втрату клітин, пересаджених у вигляді суспензії. Звідси було зроблено висновок про недоцільність корекції рубця шляхом пересадки кератиноцитів у вигляді суспензії.

Шрам щура через 2 місяці після трансплантації кератиноцитів щура.

Клінічна картина. Рубець виглядає тонким і ніжним. Місцями спостерігаються лущення та лускаті плями.

Мікроскопічна картина. Роговий шар потовщений, місцями – гіперкератоз. Епідерміс потовщений, складається з 12-20 рядів клітин. Межа між епідермісом та дермою – пряма лінія. Ніжні колагенові волокна під епідермісом залягають досить щільно. У глибших шарах рубця вони зібрані у великі грубі пучки. У субепідермальному шарі з'являються нові судинні утворення. У нижніх шарах рубцевої тканини є багато безлюдних судин, розташованих паралельно поверхні епідермісу. Великі фібробласти рівномірно розподілені в товщі рубця, є гігантські, багаторозгалужені, багато макрофагів.

Шрам щура через 5 місяців після трансплантації клітин епідермісу щура.

Клінічна картина. Рубець виглядає рівним, гладким без лущення, є поодинокі волоски, їхня щільність більша по периферії рубців, що свідчить про крайове вростання волосяних фолікулів у рубець та утворення нових волосяних фолікулів. Площа рубців продовжує зменшуватися.

Мікроскопічна картина. Епідерміс ще товстий (15-20 шарів, місцями до 30), у верхніх шарах заповнений зернами кератогіаліну. Базальна мембрана чітко видно. Під нею колагенові волокна залягають вільно. У нижніх шарах колаген потужніший і щільно упакований. Серед колагенових пучків багато капілярів. У верхніх шарах кількість пустельних судин зменшилася. Місце з'єднання епідермісу та дерми злегка хвилясте. Місцями є глибокі епідермальні вирости в рубцевій тканині. Серед колагенових волокон видно новоутворені судини. З'являються поодинокі волосяні фолікули та сальні залози.

Рубець щура через 9 місяців після трансплантації епідермальних клітин MPA щура.

Клінічна картина. Рубці стали значно меншими за розміром порівняно з попередніми періодами, їх площа в середньому становить близько 1,5-2,0 см² ^. Рубці нерівномірно вкриті дрібним волоссям, особливо по периферії. Залишається незначне дрібнопластикове лущення.

Мікроскопічна картина.

Епідерміс став тоншим, представлений 6-8 рядами клітин, за структурою нагадує епідерміс нормальної шкіри щура, тільки щільність клітин на 1 мм вища і вони менші. Базальний шар складається з дрібних округло-циліндричних клітин. Базальна мембрана добре виражена, чітко видно гемідесмосоми. Відзначається наявність епідермальних виростів у субепідермальному шарі. Папілярний шар виражений по всій довжині рубця. Ці факти свідчать про те, що до цього часу адгезія пересаджених кератиноцитів стала набагато міцнішою з підлеглими рубцевими тканинами. Тому догляд за рубцем у людей з трансплантацією MPALK через 9 місяців після трансплантації MPC може бути традиційним. Під епідермісом колагенові волокна більш ніжні, ніж у глибоких шарах. З'явилося багато судин, особливо поверхневих. Стінки більших судин потовщені. Волосяні фолікули та сальні залози знаходяться у великій кількості. Мікроскопічна картина нагадує дермоподібну тканину.

Результати експериментальної роботи та їх обговорення.

У ході цієї роботи кератиноцити в різних формах були пересаджені на штучно створені рубці шкіри щурів після операції дермабразії - на ранові покриття, у вигляді суспензії на батист та у вигляді багатошарового шару без підкладки. Робота проводилася з метою отримання морфологічних даних про вплив пересаджених алогенних кератиноцитів на рубці, а також визначення оптимальних варіантів трансплантації.

Було виявлено, що всі три методи трансплантації є здійсненними, але трансплантація MPAC без субстрату є дуже трудомісткою процедурою, під час якої MPAC може бути пошкоджений, що впливає на результати трансплантації. Крім того, цей метод трансплантації виключає роботу на великих поверхнях.

Трансплантація суспензії кератиноцитів є значно більш економічно вигідним методом, не потребує тривалого культивування клітин та є простою у запропонованому нами варіанті з використанням стерильних батистових заготовок, розміри яких відповідають розміру рубців. Затримка терапевтичного ефекту при пересадці клітинної суспензії приблизно на місяць порівняно з ГПК на ранове покриття не є суттєвим моментом при тривалості лікування багато місяців. Відомо, що при пересадці ГПК пацієнтам з опіками трансформація структури шкіри відбувається поступово та протягом кількох років. Трансплантація культури кератиноцитів на ранові покриття є найзручнішим та найперспективнішим методом, але також значно дорожчим. Крім того, наразі потрібен пошук більш досконалих варіантів покриттів, які повинні бути гнучкими, гігроскопічними, мати бактеріостатичні або бактерицидні властивості та бути біологічно нейтральними для клітин. Плівка «Поліпор» – проміжний варіант вітчизняного плівкового ранового покриття, незважаючи на деякі недосконалості, дозволила нам вивчити в експерименті трансплантацію кератиноцитів щурів на рубці та зробити висновки про ефективність цього напрямку лікування рубців.

Автори, які пересаджували МПК на опікові рани, відзначили, що протягом першого тижня після пересадки багатошарового шару кератиноцитів на сановані рани епідерміс потовщувався та розшаровувався. Усі шари епідермісу були чітко видно. Цікаво, що кількість клітинних шарів у трансплантатах була на 10-30% більшою, ніж у біоптатах шкіри. Автори відзначили появу кератогіалінових гранул на 5-й день після пересадки МПК, а базальної мембрани та гемідесмосом – вже на 3-й день.

J.Rives та ін. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM та ін. (1998) виявили, що на ранніх термінах після трансплантації МПК пацієнтам з повнорозмірними дефектами шкіри після опіків зв'язок між дермою та епідермісом дуже слабкий і являє собою пряму лінію, папілярний шар відсутній. До кінця 2-го місяця починають формуватися неглибокі сосочки та шкірні придатки, зв'язок між дермою та епідермісом стає міцнішим. Літературні дані свідчать про те, що трансплантація алогенних кератиноцитів на рани у хворих на опіки є перспективним методом. Незважаючи на те, що відторгнення алогенних кератиноцитів відбувається, за даними різних авторів, протягом від 10 днів до 3 місяців, вони тим не менш відіграють свою роль у загоєнні поверхні рани, секретуючи фактори росту та механічному закритті дефекту. Вважається, що МПКЛ мають знижену антигенну активність, оскільки під час культивування in vitro вони втрачають клітини Лангерганса, що дозволяє їм тривалий час існувати в організмі реципієнта. Крім того, алогенна культура, отримана зі шкіри молодих здорових людей, має незрівнянно більший біологічний потенціал, ніж аутологічна культура пацієнтів після травми.

Основною метою нашого дослідження було з'ясувати, чи приживуться алогенні кератиноцити на рубцях та які зміни відбудуться в рубцевій тканині під впливом такого біологічно активного «раневого покриття». У разі позитивного результату розробити найефективнішу та найменш трудомістку технологію для цієї галузі реабілітаційної медицини.

Отримані нами дані багато в чому були схожі на літературні дані щодо морфологічних змін, що відбуваються в епідермісі людини після трансплантації алогенних кератиноцитів на опікові рани. Однак існують і суттєві відмінності, як щодо морфологічного субстрату, на який відбувається трансплантація, так і щодо технології. Так, процес формування базальної мембрани та дермально-епідермальних зв'язків (гемідесмосом, сосочків) відбувається на пізнішій стадії порівняно з трансплантацією кератиноцитів на ранові поверхні без рубцевих змін. Очевидно, це відбувається через гірше живлення рубцевої тканини порівняно з дермою або м'язовою фасцією. Рубець, особливо старий, являє собою щільну сполучну тканину з дуже малою кількістю судин, тоді як дно опікової рани - це грануляційна тканина, багата на судини. Таким чином, очевидно, що умови, за яких відбувається трансплантація та приживлення кератиноцитів, абсолютно різні. Чим більше васкуляризована область трансплантації клітин, тим легше відбувається процес їх приживлення. З цього постулату випливає висновок про перевагу роботи з молодими рубцями, в яких сполучна тканина ще досить пухка та багата на судинами.

В результаті цієї експериментальної роботи було доведено, що:

1. Трансплантація MPALK на рубці можлива.
2. Оптимальним методом трансплантації є пересадка кератиноцитів на ранову оболонку.
3. Поверхню рубця слід відполірувати за допомогою хірургічної лазерної дермабразії або різця Шумана.
4. Під впливом МПАЛК відбувається швидка епітелізація полірованої поверхні рубця.
5. Чим краще васкуляризована рубцева тканина, тобто чим молодший рубець, тим кращі результати трансплантації кератиноцитів.
6. Під впливом пересаджених кератиноцитів рубцева тканина поступово трансформується і перетворюється на дермоподібну (більш пухку рубцеву тканину зі шкірними придатками).
7. Поступове розпушення рубцевої тканини, починаючи з субепідермального шару. Покращується її васкуляризація, пучки колагенових волокон у верхній та нижній частинах рубця приймають більш пухке розташування, ніж у рубцевій тканині без трансплантації клітин. З'являються волосяні фолікули та сальні залози. Епідерміс за своєю структурою, пройшовши фазу гіпертрофії, наближається до епідермісу нормальної шкіри.
8. Спостережувані зміни пов'язані з факторами росту та цитокінами, що виділяються кератиноцитами, які, покращуючи трофіку рубцевої тканини, сприяють її перетворенню з грубої фіброзної тканини на більш пухку, що призводить до покращення зовнішнього вигляду рубця.

Таким чином, на основі цього дослідження можна зробити висновок, що трансплантовані кератиноцити мають позитивний вплив на рубцеву тканину, що може мати практичні наслідки для реабілітації пацієнтів з різними типами рубців.

Ця робота на щурах також дозволила нам сформулювати вимоги до ранових покриттів, на яких вирощуються кератиноцити.

Пов'язки для ран повинні бути:

• біосумісний з клітинами,
• дихаюча,
• мають еластичну, формоутворюючу основу,
• бути гідрофільним,
• як лікувальні добавки містять антибактеріальні препарати та антиоксиданти, які не є токсичними для культивованих клітин.

Клінічні результати біотехнологічного лікування рубців.

Раніше Н. Карвер та ін. (1993) виявили, що оклюзійні пов'язки найкраще сприяють прикріпленню до рани та виживанню кератиноцитів, але не дозволяють утворюватися стратифікованому (зрілому) епідермісу. Для формування стратифікованого епідермісу необхідне повітряне середовище. Тому після прикріплення багатошарового шару було запропоновано знімати оклюзійну ранову пов'язку через 7-10 днів та лікувати рани під сухими пов'язками або водорозчинними мазями. Можна сказати, що якість та властивості «субстрату», на якому вирощуються клітини, є дуже важливим моментом для ефективності трансплантації клітинного матеріалу, а отже, і для результатів роботи лікарів. Але ідеальної ранової пов'язки сьогодні не існує, незважаючи на велику кількість запропонованих варіантів (штучна шкіра, неткане полотно з карбоксиметилцелюлози, фібринові покриття, напівпроникні поліуретанові плівки). Важливим моментом у цьому питанні є вартість «субстратів» (спеціальних ранових покриттів), оскільки їх висока вартість збільшує загальну вартість біотехнологічного лікування.

Ефективність клітинних технологій на сьогоднішній день доведена, але, на жаль, ці технології є дуже дорогими, особливо в країнах, де не налагоджено промислове виробництво клітинних композицій. Однак такі країни, як США, давно створили промисловість з виробництва клітинного матеріалу для трансплантації опіків. Зокрема, компанія BioSurface Technology Inc., починаючи з 1989 року, виростила 37 000 багатошарових шарів кератиноцитів, які були використані для лікування 240 пацієнтів у 79 країнах світу (R. Odessey, 1992), при цьому 1 см² клітинної культури ^коштує близько 7-8 доларів США.

Технологія лікування різних шкірних захворювань та проблем має ряд відмінностей, але будь-яке клітинне лікування базується на отриманні високоякісного клітинного матеріалу та його трансплантації.

Цей процес складається з таких кроків:

• взяття шкіри у жертв (або у донорів),
• транспортування шкірних клаптів до біотехнологічного центру,
• виділення клітин базального шару та їх проліферація,
• ріст багатошарових шарів кератиноцитів (MLK).
• трансплантація клітинної культури.

Основною проблемою проведення лікування за допомогою трансплантації багатошарових кератиноцитарних листків є необхідність життєздатних клітин на всіх етапах клітинної трансплантації. Шматочки шкіри для виділення аутологічних або алогенних клітин повинні бути якомога тоншими, оскільки в цьому випадку їх легше відокремити за допомогою механічних та ферментативних методів та отримати суспензію живих клітин для культивування. Їх можна отримати шляхом зрізання дерматомом або використовуючи шкіру повік, крайньої плоті та внутрішньої поверхні плеча. Враховуючи, що клітини чутливі до галогенів (хлор, йод), перекису водню, їх не можна використовувати при обробці шкіри під час забору матеріалу.

Кількісний та якісний вихід клітин зі шкірних трансплантатів та ефективність їх культивування також залежать від здоров'я та віку донора. Крім того, біопсії шкіри повинні бути доставлені якомога швидше та за відповідних умов (навколишнє середовище, температура) до лабораторії, сертифікованої та акредитованої для цих цілей.

Для зберігання та транспортування шкірних клаптів можна використовувати середовище Ігла або середовище 199 з додаванням 10% бичачої сироватки, середовище DMEM з додаванням 5% фетальної бичачої сироватки та антибіотиків.

У цитологічній лабораторії біопсію шкіри спочатку механічно розділяють на дрібні шматочки, потім шматочки шкіри обробляють за допомогою ферментів: трипсину, колагенази, диспази тощо.

Під дією ферментів десмосоми руйнуються, а кератиноцити вивільняються в середовище у вигляді окремих клітин або агрегатів, що складаються з різної кількості клітин. Для культивування використовуються лише базальні кератиноцити, які вирощують на спеціальних середовищах у термостатах, що містять 5% CO2, у чашках Петрі або в колбах при t = 37°C. Вже через 48 годин спостерігається утворення колоній кератиноцитів, які поступово зливаються, перетворюючись на моношар. Після отримання достатньої кількості клітин отриману суспензію висівають на підготовлені для цієї мети ранові пов'язки та поміщають у чашки Петрі. Спочатку з суспензії формують моношар, а потім багатошаровий шар кератиноцитів. Етапи процесу культивування кератиноцитів схематично показані на рис. 12 (33,43,54,65).

Формування багатошарового шару кератиноцитів, придатного для трансплантації, зазвичай займає 7-10 днів. Іноді цей період довший, що залежить від якості вихідного матеріалу (віку, стану здоров'я донора, правильності забору матеріалу, якості використаних середовищ тощо). Якщо багатошаровий шар надмірно розростається, то на його поверхні можуть з'явитися клітини з явищами апоптозу, непридатні для трансплантації. Чашки Петрі з вирощеними в них багатошаровими шарами кератиноцитів (МШК) на ранових покриттях доставляють до клініки у спеціальних контейнерах за температури не нижче +15°C.

Модифікований метод Гріна для вирощування MPC

У нашій роботі ми використовували багатошаровий батист як покриття для ран, відмовившись від плівок "Polypor", з якими ми починали працювати в експерименті з щурами. Таким чином, ми вирощували багатошарові шари кератиноцитів на попередньо знежиреному та стерильному батисті, хоча він також не є оптимальним покриттям для ран.

Клінічні дослідження проводилися на добровольцях з дотриманням необхідних етичних стандартів: підписання угоди та інформованої згоди.

1. Була використана культура власних (аутологічних) та збережених (алогенних) кератиноцитів пацієнта.
2. Власні кератиноцити пацієнтів були отримані зі шматочка шкіри, вирізаного з внутрішньої сторони їхнього плеча.
3. Операцію з дермабразії рубців проводили за допомогою термокаутера, роторних дисків та ербієвого лазера.
4. Були взяті групи пацієнтів з нормотрофічними, гіпотрофічними та гіпертрофічними рубцями.

Технологічний процес застосування клітинної технології для покращення зовнішнього вигляду шкірних рубців складався з таких етапів:

1. Відбір пацієнта.
2. Пояснення суті лікування, часових рамок отримання очікуваних результатів, підписання договору та інформованої згоди.
3. Призначити пацієнтам за 2-3 тижні до операції селмевіт по 1 таблетці 3 рази на день, цинктерал по 1 таблетці 3 рази на день.
4. Взяття шматочка шкіри довжиною 2,0 см та шириною 0,7-1,0 см з внутрішньої поверхні плеча, високо, майже в нижній частині пахвової області для отримання аутологічних кератиноцитів.
5. У випадках, коли пацієнти відмовлялися від виділення власних кератиноцитів через можливість утворення лінійного рубця на внутрішній поверхні плеча, клітинний матеріал брали з банку клітин (алогенні кератиноцити).
6. Кератиноцити були виділені та вирощені в лабораторії, атестованій для цього виду робіт.
7. Після отримання достатньої кількості ГПК для пересадки на рубці, було призначено день операції в клініці, куди матеріал привезли у спеціальних контейнерах у чашках Петрі.
8. Була проведена операція дермабразії рубця, гемостаз, полірована поверхня промита стерильним фізіологічним розчином, висушена, після чого на неї на стерильний батист пересаджені ГДК (мікроклітини вниз). Тобто клітини, які були зверху в ГДК, виявилися нижчими, що прилягали до полірованої поверхні.
9. Зверху накладали стерильну плівку, яку фіксували до шкіри еластичним бинтом або еластичним пластиром Omnifix. Замість плівки можна використовувати індиферентні пов'язки на рани, що містять силікон, наприклад, Mepitel, Mepiform, силіконові гелеві листи.

Через 5-7 днів плівку або силіконове покриття видаляють. До цього часу всі кератиноцити повинні виповзти на полірований рубець і прикріпитися до його поверхні.

10. Вологе середовище, що створюється під плівкою та силіконовим покриттям, активно сприяє цьому. Батист, що залишився на рубці з цього моменту, можна просочити куріозином або хітозановим гелем. В результаті на 2-й день створюється щільна кірка, яку для зручності пацієнта найкраще закріпити еластичним, дихаючим пластиром, таким як Omnifix. Дихаюча кірка дозволяє сформованому епідермісу диференціюватися та перетворюватися на зрілий.

Залежно від типу рубця та глибини сточування, пов'язка відторгається через 8-10 днів. У цей час в епідермісі на 30-40% більше клітинних шарів, ніж у нормальній шкірі. Базальна мембрана не сформована. Кератиноцити потовщеного епідермісу виділяють у рубцеву тканину багато біологічно активних молекул.

Успіх біотехнологічного лікування рубців значною мірою залежить від методу догляду в післяопераційному періоді. Клітинні культури є «щадним» типом покриття ран і на ранніх стадіях після трансплантації МПК легко відшаровуються від підлеглих тканин. Тому пацієнтам рекомендується обережно поводитися з рубцем після операції. Протягом 8-9 місяців не терти та обережно обробляти холодною кип’яченою водою, щоб уникнути відриву тонкого, новоствореного епідермісу, який не має щільного зв’язку з підлеглими тканинами.

Примітка.

Перед хірургічним втручанням та під час дермабразії допустимо використання галогенованих антисептиків та окислювачів (йодопірон, суліодопірон, йодинол, йодинат, хлоргексидин, перекис водню), перед трансплантацією клітин – суворо протипоказано через їх цитотоксичну дію. Метиленовий синій та діамантовий зелений також токсичні для клітин.

Щоб уникнути інфекції, особливо при роботі з гіпертрофічними рубцями, операційне поле можна обробити неоміцину сульфатом, поліміксином або гентаміцином. Вони не мають цитотоксичної дії на кератиноцити.

В результаті такого лікування досягається потрійний ефект.

1. Вирівнювання поверхні рубця.
2. Створення над ним шару нового епідермісу нормальної товщини.
3. Трансформація рубцевої тканини в дермоподібну тканину зумовлена дією цитокінів, факторів росту та інших біологічно активних молекул, що секретуються трансплантованими клітинами та стимульованими ними кератиноцитами, фібробластами та макрофагами.

Рубець стає менш помітним, більш еластичним, у ньому з'являються пори та пушкове волосся, а пігментація може відновитися завдяки наявності меланоцитів у МПК.

Однак усі ці позитивні аспекти рубця виникають не одразу. У зв'язку з цим необхідно попередити пацієнтів, що процес перетворення рубцевої тканини на дермальну відбувається повільно і оптимального результату такого лікування можна очікувати не раніше ніж через 10-14 місяців. Відразу після відторгнення пов'язок поліровані поверхні мають виражену поліхромію, тим яскравіша, чим глибше було проведено полірування. Найменше пошкодження шкіри відзначається при поліруванні нормотрофічних рубців ербієвим лазером. Колір рубців та навколишньої шкіри відновлювався протягом 3 - 8 тижнів. Незважаючи на такі запобіжні заходи, іноді виникає післяопераційна гіперпігментація, яка може зникнути самостійно протягом кількох місяців.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]